Neue CRISPR-Methode enthüllt Genregulation einzelner Zellen
Zwei revolutionäre Werkzeuge der biomedizinischen Forschung bilden die Grundlage für eine neue Technologie zur Analyse der Genregulation: Wissenschaftler des CeMM Forschungszentrum für Molekulare Medizin der Österreichischen Akademie der Wissenschaften kombinieren CRISPR-„Genscheren“ mit der RNA-Sequenzierung einzelner Zellen. Die in Nature Methods publizierte Methode ermöglicht Einblicke in die genetische Steuerung von menschlichen Zellen in bisher unerreichtem Ausmaß und Detail.
Mikro-Tropfen mit einzelnen, CRISPR-editierten Zellen
Paul Datlinger/CeMM
Das als „Genscheren“ bekannt gewordenen CRISPR/Cas9-Verfahren, dessen Entdeckung als nobelpreisverdächtig gilt, ist ein wichtiges Werkzeug der biomedizinischen Forschung. Wissenschaftler suchen damit nach neuen biologischen Mechanismen, indem sie viele Zellen mit CRISPR genetisch verändern. Anschließend wird gezählt, welche Gene die Überlebensfähigkeit der Zellen in bestimmten Experimenten erhöhen.
Diese Methode eignet sich besonders für technisch einfachere Fragestellungen, die das Wachstum und das Überleben von Zellen betreffen – zum Beispiel für die Suche nach Genen, die Krebszellen vor einer Chemotherapie schützen oder die eine Virusinfektion abwehren. Um jedoch die komplexen Abläufe der Genregulation einer Zelle zu verstehen, reicht der Ansatz nicht aus. Stattdessen mussten die Zellen bisher separat genetisch verändert, separat kultiviert und auch separat auf die Aktivität ihrer Gene untersucht werden – ein zeitaufwendiger und teurer Prozess.
Hier schafft das Team von Christoph Bock, Forschungsgruppenleiter am CeMM, mit einer neu entwickelten Methode Abhilfe: Diese kombiniert CRISPR mit einer Spezialtechnologie zur Einzelzell-Sequenzierung, bei der die Genaktivitäten jeder einzelnen Zelle ohne vorherige Separierung bestimmt werden können. Damit gelang es dem Team, die komplexen Auswirkungen der CRISPR-induzierten Genveränderungen auf die Genaktivität in Tausenden von Einzelzellen parallel zu analysieren. So konnten sie das Zusammenspiel von Genen und Genregulation in hoher Auflösung und für sehr viele Gene gleichzeitig aufklären.
Das „CROP-seq“ (Kurzform für “CRISPR droplet sequencing”) getaufte Verfahren verbindet zwei moderne Technologien auf elegante Weise: Eine von Erstautor Paul Datlinger eigens für diese Studie entworfene Genfähre macht die CRISPR guide-RNA, mit der die Genscheren zu ihrer Schnittstelle im Genom geführt werden, für die RNA-Sequenzierung sichtbar. Anschließend wird mit neuesten Methoden zur Einzelzell-Sequenzierung („droplet RNA sequencing“) die Aktivität der Gene ausgelesen – mit ausreichendem Durchsatz, um den Effekt von Genomveränderungen in tausenden einzelner Zellen charakterisieren zu können.
Mit CROP-seq ist es erstmals gelungen, Genregulation genomweit mit hohem Durchsatz und mit Einzelzell-Genauigkeit zu untersuchen. Dank der sinkenden Preise für die RNA-Sequenzierung einzelner Zellen könnten mit dieser Methode in den nächsten Jahren die ersten vollständigen Karten der regulativen Effekte aller 23.000 Gene des menschlichen Genoms erstellt werden.
„Am CeMM werden wir CROP-seq besonders dazu verwenden, das Zusammenspiel von genetischen und epigenetischen Faktoren bei der Entstehung von Leukämie zu untersuchen“, erklärt Christoph Bock, dessen Labor vor kurzen ein vom Europäischen Wissenschaftsrat (ERC) finanziertes Projekt zur Epigenom-Programmierung in Krebszellen gestartet hat. „Wenn wir verstehen, wie im Reagenzglas aus einer gesunden Zelle eine Krebszelle wird, dann können wir diesen Prozess gezielt stören und vielleicht auch umkehren.“
Die CROP-seq Methode wurde als „Open Source“ entwickelt. Alle Daten, Protokolle, Reagenzien und die Software werden vom CeMM frei und offen zur Verfügung gestellt, so dass andere Wissenschaftler die neue Methode schnell und einfach für ihre eigenen Forschungen nutzen können. So soll die effektive Weiterführung der gewonnen Erkenntnisse sichergestellt werden – ein Bestreben, das für die Forschung am CeMM einen hohen Stellenwert einnimmt.
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