Einen Stammbaum für jede Körperzelle in Echtzeit erstellen
Sich entwickelnde genetische Barcodes zeigen die Zellherkunft
Alle Menschen beginnen ihr Leben als eine einzige Zelle, die sich immer wieder zu zwei, dann zu vier, dann zu acht Zellen teilt, bis hin zu den ~26 Milliarden Zellen, die ein Neugeborenes ausmachen. Wie und wann diese 26 Milliarden Zellen aus einer Zygote entstehen, ist die große Herausforderung der Entwicklungsbiologie, die bisher nur Momentaufnahmen des Entwicklungsprozesses erfassen und analysieren konnte.
Während sich eine Maus entwickelt, erbt jede Zelle hgRNA-Sequenzmutationen von ihrer Mutterzelle und erwirbt ihre eigenen einzigartigen Mutationen, die sie dann an ihre Nachkommen weitergibt. Durch den Vergleich des Musters von Mutationen zwischen Zellen in verschiedenen Teilen des Körpers (Lunge, Leber und Neuronen, in diesem Bild), können Wissenschaftler feststellen, wann sich diese Teile entwickelt haben und wie eng sie miteinander verwandt sind.
Wyss Institute at Harvard University
Eine neue Methode, die von Wissenschaftlern des Wyss Institute und der Harvard Medical School (HMS) entwickelt wurde, bringt diese gewaltige Aufgabe endlich in den Bereich des Möglichen, indem sie sich entwickelnde genetische Barcodes verwendet, die den Prozess der Zellteilung bei der Entwicklung von Mäusen aktiv aufzeichnen, so dass die Abstammung jeder Zelle im Körper einer Maus bis zu ihrem einzelligen Ursprung zurückverfolgt werden kann.
"Die derzeitigen Methoden der Linienverfolgung können nur Momentaufnahmen in der Zeit zeigen, weil man den Entwicklungsprozess physisch stoppen muss, um zu sehen, wie die Zellen in jedem Stadium aussehen, fast wie bei einzelnen Bildern eines Films", sagte der Seniorautor George Church, Ph.D., der ein Gründungsmitglied der Core Faculty am Wyss Institute, Professor für Genetik an der HMS und Professor für Gesundheitswissenschaften und Technologie am Harvard und MIT ist. "Diese Barcode-Erfassungsmethode erlaubt es uns, die komplette Geschichte der Entwicklung jeder reifen Zelle zu rekonstruieren, was so ist, als würde man den gesamten Film in Echtzeit rückwärts abspielen."
Die genetischen Barcodes werden mit einer speziellen Art von DNA-Sequenz erzeugt, die für ein modifiziertes RNA-Molekül, die so genannte Homing Guide RNA (hgRNA), kodiert, die in einer früheren Arbeit entwickelt wurde. hgRNA-Moleküle sind so konstruiert, dass, wenn das Enzym Cas9 vorhanden ist, die hgRNA das Cas9 zu seiner eigenen hgRNA-Sequenz im Genom dirigiert, die dann von Cas9 geschnitten wird. Wenn die Zelle diesen Schnitt repariert, kann sie genetische Mutationen in die hgRNA-Sequenz einbringen, die sich mit der Zeit zu einem einzigartigen Barcode ansammeln.
Die Forscher implementierten das hgRNA-Cas9-System in Mäusen, indem sie eine "Gründermaus" schufen, die 60 verschiedene hgRNA-Sequenzen in ihrem Genom verstreut hatte. Dann kreuzten sie die Gründermaus mit Mäusen, die das Cas9-Protein exprimierten, und produzierten Zygoten, deren hgRNA-Sequenzen kurz nach der Befruchtung geschnitten und mutiert wurden.
"In jeder einzelnen Zelle, zu der sich die Zygote teilt, besteht die Chance, dass ihre hgRNAs mutieren", erklärt Erstautor Dr. Reza Kalhor, Postdoktorand am Wyss Institut und an der HMS. "In jeder Generation erwerben alle Zellen ihre eigenen Mutationen, zusätzlich zu denen, die sie von ihrer Mutterzelle erben, so dass wir durch den Vergleich ihrer Mutationen nachvollziehen können, wie eng die verschiedenen Zellen miteinander verwandt sind."
Jede hgRNA kann hunderte von mutierten Allelen produzieren; gemeinsam können sie einen einzigartigen Barcode erzeugen, der die vollständige Entwicklungslinie jeder der ~10 Milliarden Zellen einer erwachsenen Maus enthält.
Die Fähigkeit, die Entwicklung der Zellen kontinuierlich aufzuzeichnen, erlaubte es den Forschern auch, eine langjährige Frage bezüglich des embryonalen Gehirns zu klären: Unterscheidet es zuerst seine Vorderseite von seinem hinteren Ende, oder seine linke von seiner rechten Seite zuerst? Durch den Vergleich der hgRNA-Mutations-Barcodes in Zellen, die aus verschiedenen Teilen des Gehirns von zwei Mäusen stammen, fanden sie heraus, dass Neuronen von der linken Seite jeder Gehirnregion enger mit Neuronen von der rechten Seite derselben Region verwandt sind als mit Neuronen von der linken Seite benachbarter Regionen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass bei der Entwicklung des zentralen Nervensystems eine Gehirnstrukturierung von vorne nach hinten vor einer Strukturierung von links nach rechts auftritt.
"Diese Methode erlaubt es uns, das letzte Entwicklungsstadium eines Modellorganismus zu nehmen und von dort aus einen vollständigen Stammbaum bis zu seinem einzelligen Stadium zu rekonstruieren. Es ist ein ehrgeiziges Ziel, das sicherlich viele Laboratorien mehrere Jahre in Anspruch nehmen wird, aber dieses Werk stellt einen wichtigen Schritt auf dem Weg dorthin dar", sagte Church. Die Forscher konzentrieren sich nun darauf, ihre Auslesetechniken zu verbessern, um die Barcodes einzelner Zellen zu analysieren und den aufgezeichneten Linienbaum zu rekonstruieren.
"Die Fähigkeit, Zellen kontinuierlich über die Zeit aufzuzeichnen, ist ein großer Meilenstein in der Entwicklungsbiologie, der unser Verständnis des Prozesses, durch den eine einzelne Zelle zu einem erwachsenen Tier heranwächst, exponentiell verbessern wird. Wenn wir diese Erkenntnisse auf Krankheitsmodelle übertragen, können wir so völlig neue Einsichten in das Entstehen von Krankheiten wie beispielweise Krebs gewinnen," erklärt Donald Ingberg, Ph.D., Gründungsdirektor des Wyss Institute, der auch der Judah Folkman Professor für Gefäßbiologie an der HMS und das Vascular Biology Program am Boston Children's Hospital ist, sowie Professor für Bioengineering an der John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences (SEAS) in Harvard.
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