Nachweis von geringsten Proteinmengen durch Aptamere und PCR

06.02.2006

Manchmal reichen wenige Moleküle eines Proteins, um wichtige physiologische Vorgänge in einer Zelle zu steuern oder Krankheiten auszulösen. Während der Nachweis winzigster DNA-Mengen dank der Polymerasekettenreaktion (PCR) bereits zu den Standardtechniken zählt, gibt es bisher noch keine Technik, die Eiweißmoleküle mit vergleichbarer Empfindlichkeit nachweist. Wissenschaftler von der University of Alberta in Kanada haben nun eine ultrasensitive Methode zum Proteinnachweis entwickelt. Sie basiert auf kurzen DNA-Sonden ("Aptameren"), die spezifisch an ein gesuchtes Protein binden, und deren Vervielfältigung durch PCR.

Um seine neue Methode zu testen, wählte das Team um Chris Le die HIV-1-Revers-Transkriptase (HIV-1-RTase) als Zielprotein, ein Enzym, das beim Lebenszyklus des HI-Virus eine wichtige Rolle spielt. Um das Protein zu detektieren, setzten sie ein spezifisches Aptamer ein, das dieses Protein bindet. Aptamere sind dreidimensional gefaltete kurze Ketten aus DNA-Bausteinen, die andere Nucleinsäuren oder Eiweißmoleküle, aber auch kleine organische Moleküle hochspezifisch erkennen und daran binden können.

Heute gibt es Methoden, um solche Aptamere gezielt zu generieren. Dabei wird aus einer riesigen Zahl nach dem Zufallsprinzip erzeugter DNA-Sequenzen nach "Treffern" gesucht und die ausgewählte Sequenz dann vervielfacht. So erzeugten die Forscher wählten ein für ihr Zielprotein, die HIV-1-RTase, spezifisches Aptamer bekannter Sequenz. Ist diese in einer Probe vorhanden, bindet das Aptamer daran. Anschließend trennen die Forscher mit Hilfe der Kapillarelektrophorese die Aptamer-RTase-Komplexe von den anderen Bestandteilen der Probe - und damit auch von ungebundenem Aptamer. Diese Trennmethode nutzt die Geschwindigkeitsunterschiede von Molekülen beim Durchwandern eines hauchfeinen Röhrchens entlang eines elektrischen Feldes.

Die Fraktion, die die Aptamer-RTase-Komplexe enthält, wird einer PCR unterzogen. Ausgehend von einer Starter-DNA, die spezifisch die Sequenz des Aptamers erkennt, werden ausschließlich "Kopien" des Aptamers gezogen, die Anzahl der Aptamermoleküle also vervielfacht und diese dann detektiert. So gelang es den Forschern, die geringe Menge von nur 180 Molekülen der RTase nachzuweisen. Damit liegt die Nachweisgrenze der Aptamer-Methode um mehrere Größenordnungen niedriger als bei herkömmlichen Techniken.

Da Aptamere passend zu nahezu allen Proteinen generiert werden können, ist die Technik für universell anwendbar für den Nachweis von Proteinen. Anhand von Kalibrierungen ist eine Quantifizierung möglich.

Originalveröffentlichung: C. Le et al.; "Ultrasensitive Detection of Proteins by Amplification of Affinity Aptamers"; Angewandte Chemie 2006.

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